FRET 技术（Fluorescence Resonance Energy Transfer）能够在突破传统光学分辨率极限的条件下研究蛋白互作、构象变化（<10 nm），或者通过构建 FRET 探针监测分子变化，因而在诸多研究领域得到了“科研大拿”们的青睐。然而，传统的基于荧光强度的 FRET 技术（如 FRET-AB、FRET-SE 等）容易受到荧光蛋白浓度、激光强度、荧光漂白等众多因素的影响，从而直接导致了实验结果的不准确性和难重复性，着实让人头疼！

△ 图1. 常用 FRET 染料对 Alexa488-Cy3 的 Jablonski 图表

FLIM 显微成像技术

FLIM-FRET 的优势

FLIM(Fluorescence Life-time Imaging Microscopy) 是一项基于荧光寿命（电子驻留在激发态的时间统计值）的显微成像技术。与荧光光谱一样，荧光寿命也是荧光物质的一种内在特有性质，不受荧光物质浓度、激发光强度等因素的影响。基于荧光寿命测量的 FRET 技术—— FLIM-FRET，具有 FLIM 和 FRET 两者的优势，即能在不受荧光强度影响因素影响的条件下，在纳米分辨率水平对蛋白互作进行研究，或者通过 FRET 探针研究分子环境变化，更重要的是其测量数据准确性高、易重复，接下来我们来看两个例子。

案例解析

案例一

离子溶度监测

今年发表在 Nature Immunology 上的文章 “An essential role for the Zn2+ transporter ZIP7 in B cell development” 研究了 ZIP7 蛋白在 B 细胞中的重要作用。

作者通过对免疫缺陷病人进行基因筛查，发现了 ZIP7 蛋白的缺失，利用 CRISPR-CAS9 技术构建了该基因缺失的小鼠模型，并利用该模型证明了 ZIP7 缺失会导致 B 细胞发育受阻。ZIP7 介导 Zn²⁺ 由内质网流入细胞质，为了证明 ZIP7 缺失的细胞中 Zn2+ 浓度受到了影响，作者通过 FRET 探针 eCALWY-4、eCALWY-6 进行了研究，然而传统的FRET技术会受到探针浓度的影响从而导致结果不准确，因此作者利用了 FLIM-FRET 技术，证明 ZIP7 突变体细胞质中 Zn2+ 浓度明显下降，后续的实验进一步证明了 ZIP7 调控的 Zn2+ 水平对 B 细胞发育的重要性。

△ 图2. 利用 FLIM-FRET 技术检测细胞质和内质网中 Zn2+ 浓度。P198A Hom，ZIP7 突变体；eCALWY-4、eCALWY-6 ，Zn²⁺  FRET reporters ; ER，内质网

案例二

活体功能成像

FRET 探针不仅可用在细胞水平，in vivo 个体水平也同样适用。

“Removing physiological motion from intravital and clinical functional imaging data” 一文利用 Rac1 FRET 探针对小鼠小肠、胰腺等组织中的 Rac1 活性进行了监测。然而，传统的 FLIM 技术成像速度非常慢，在活体应用时，由于时间分辨率不够会导致数据的假象。该文通过算法将这种成像速度不够导致的假象进行了*大程度的消除，从而在一定程度上促进了 FLIM 在活体水平的应用，该文章发表在2018年 eLife 杂志上。

△ 图3. 左，Rac1 FRET 探针检测小肠隐窝处 Rac1 活性模式图；右，运动补偿运算前后 FLIM 数据对比

SP8 FALCON *快速荧光寿命成像

解决 FLIM 成像速度*大瓶颈

当然， FLIM 应用并不仅限于 FLIM-FRET，通过 FLIM 还可以对样本所处的微环境进行检测、对样品组份进行分离等等。在传统的荧光强度和荧光光谱两个维度的基础上，又增加了荧光寿命这一新的成像维度，大大拓展了该系统的应用范围。

然而，正如 Sean C Warren eLife 文章所说，FLIM 成像速度慢是限制其应用的*大瓶颈。

Leica*新 SP8 FALCON *快速荧光寿命成像解决方案，使 FLIM 成像速度提升了近10倍（较经典 TCSPC 方法），近共聚焦的成像的速度几乎能满足所有动态过程的速度要求，可轻松实现 XYZTλ 多方式快速荧光寿命成像。