奥林巴斯显微镜专业技术知识

当在光学显微镜中对样品进行成像时，强度和/或颜色的差异会产生图像对比度，这使得样品的各个特征和细节变得可见。对比度定义为图像和相邻背景之间的光强度相对于整体背景强度的差异。通常，人眼需要0.02（2％）的最小对比度值来区分图像和背景之间的差异。对于其他检测器，如胶片，摄像机或光电检测器（CCD和CMOS设备），最小对比度通常是不同的值。对于每个检测器，信噪比（噪声是光学系统中没有图像信息的所有光）必须足够大以根据形成相干图像来解释。

通过吸收光，亮度，反射率，双折射，光散射，衍射，荧光或颜色变化而在样品中产生的对比度已经成为在明视野显微镜下成像样品的经典手段。细节突出背景或其他相邻细节的能力是样本对比度的度量。就一个简单的公式而言，对比可以描述为：

对比度（C）=（（I（s）-I（b））×100）/ I（b）

其中I（b）是背景的强度和I（小号）是试样的强度。从这个等式中可以看出，样本对比度是指图像中最高和最低强度之间的关系。图1所示的图表说明了背景强度对比度的影响。当背景是非常暗的灰色（I（b）等于0.01）时，图像强度的微小变化会导致对比度的巨大变化。通过将背景变浅为稍浅的灰色（I（b）等于0.10），图像强度的小改变提供了有用的对比度范围。在更轻的背景色（I（b） > 0.20），图像对比度对背景强度相对不敏感，而I（b）的较大变化仅产生图像对比度的小幅增加或减少。

虽然在现代显微镜中发现的光学系统可能能够在高放大率下产生高分辨率图像，但如果图像中没有足够的对比度，则这种能力是毫无价值的。对比度不是样本的固有属性，而是取决于样本与光的相互作用以及光学系统的效率，以及其与检测器可靠记录此图像信息的能力。显微镜光学系统中图像对比度的控制取决于几个因素，主要是光圈光阑的设置，光学系统中的像差程度，采用的光学对比系统，样本类型和光学检测器。显微镜中有几个可以调节对比度的部位。这些包括场孔，聚光器孔径，

由于人眼通过图像中产生的对比度来感知物体，因此人们很容易就会误入歧途，除非知道在图像中产生对比的光学事件。图2显示了相同视场的三个显微照片，其包含在不同对比模式下用光学显微镜成像的透明，无色人脸颊细胞：明场，相衬和霍夫曼调制对比度。很明显，这三幅图像显得不同，并且由于这些变化，显微镜专家可能会从每个视场得出不同的结论。图2（a）中显示的细胞用显微镜在明场模式下操作成像，聚光器光圈足够关闭以使样品边缘可见。

图2（b）显示了使用相差光学元件的脸颊细胞的相同视场。注意黑暗的内部区域和围绕物体边缘的明亮外部区域，如细胞膜和细胞核（称为晕圈，并且是伪像）。在这个视图中，很难指定单元格的边缘并解释图像中暗区和亮区的原因。细胞也显得很平坦。最后，图2（c）所示的细胞使用Hoffman调制对比度成像，其中图像的一侧是黑暗的，而其相反侧是明亮的，导致伪三维物体的感知。图2中的每个视场提供了不同的标本图像，并导致了不同的解释，只能通过关于显微镜如何创建这些图像的知识来解译这些解释。

对于光学显微镜中的许多标本，尤其是未染色或活体材料，对比度非常差，以至于标本基本上保持不可见，而不管目标是否能够解决或清楚分离细节。通常，对于这样的标本，重要的是不要通过杀死或用化学染料或固定剂处理来改变它们。这种必然性使得显微镜专家们尝试了超过百年的对比度增强技术，试图改善样品的可见性，并在不改变样品本身的情况下为图像带来更多细节。通常的做法是将聚光器孔径光阑减小到推荐的尺寸以下，或降低平台聚光器以增加试样的对比度。不幸的是，虽然这些演习确实会增加对比度，

在讨论光学显微镜控制对比度的方法之前，考虑光线和物质如何相互作用的特性很有用。负责照亮样品的光可以是空间相干的，不相干的或部分相干的。例如，光束可以以狭缝或环形的形式成形，并且可以由在垂直于传播方向的所有方向上振动的选定波长或由于偏振而在单个方向上振动。

一些标本被认为是幅度物体，因为它们部分或完全吸收光线，因此可以使用传统的明场显微镜容易地观察到。其他天然彩色或用化学染料人工染色的其他颜料也可以用显微镜清晰地成像。这些污渍或自然色吸收部分穿过的白光，并透射或反射其他颜色。通常情况下，染色结合产生对比色，例如蓝色苏木精染色细胞核结合粉红色伊红胞质。在不容易吸收光线的标本上使用污渍是一种常见做法，因此可以使这些图像在眼睛上可见。

其他标本不吸收光并被称为相位对象。由于人眼只能检测强度和颜色差异，因此必须将物体引起的相位变化转换为强度差异。相样品的特征包括几个标准，包括它们的形状（通常是圆形或平面），内部光散射元件的密度，厚度以及独特的化学或电学结构特性（统称为折射率）。厚的样本可能比较清晰，只包含少数光散射元素，或者它们可能含有许多不透光的散射元素，使样本对传输的照明有效不透明。这些标本通常被称为反射光标本。

当考虑光学方法来增强样本对比度时，考虑样本的各种特征是有用的，可以对样本进行处理以创建这些特征的强度变化以使其可见。一个主要问题是，在一组独特的环境下，物体的哪个特征会转变为不同的强度。

只要试样与其周围介质（周围环境）之间存在折射率差异，试样的细节和边缘的大小接近成像光的波长将衍射或散射光。 折射率定义为光通过空气或真空的速度除以通过物体的光速的比率。由于通过任何材料的光速小于光在真空中的速度，对于用显微镜检查的样品，折射率总是超过1.0的值。为了解决物体之间的小距离并以合理的保真度重现其形状，必须通过显微镜物镜捕获大角度的衍射光。

由物镜聚集衍射（或偏离）光必须被带入在图像平面上的锐聚焦，以便产生样本详细地，如在图3中示出。在图像平面，包括衍射光的光波经受干扰与非衍射光。干涉后光线的可见度很大程度上取决于照射样品的光的相干性，通过增加相干性，可见度逐渐增加。在光学显微镜中，聚光器孔径光阑开口大小控制撞击在样品上的光的空间相干性。减小光阑开口尺寸会产生更大的空间连贯性。

显微镜专家长期以来一直依靠减小聚光器孔径光阑开口尺寸来增加相样品中粒子和边缘的可见度。振幅对象的对比度也可以通过适当调整聚光器孔径来改善。小物体，边缘和微粒将衍射光线，无论它们属于振幅还是相位样本。由于物镜的数值孔径限制，只有一部分衍射光被物镜捕获（见图3）。未收集的剩余衍射光代表丢失的图像信息。聚光器孔径光阑开口尺寸的正确设置是试样图像对比度增强和衍射伪影引入之间的折衷。这些表现在分辨率的丧失，衍射环的叠加以及源自样本中不共同聚焦的区域的其他不期望的光学效应。随着衍射极限逼近，随着物体细节变小和空间频率变大，图像对比度变得更低。

Inoué和Spring将图像对比度与样本对比度以及实际和理想化正弦图像占据位置的相移比作为光学传递函数（OTF）描述为空间频率的函数。在来自试样的光的分布变为正弦的情况下，光学传递函数的模量变成调制传递函数（MTF）。随着空间频率的增加，调制传递函数减小，样本对比度降低。

对于每个目标，具体的调制传递函数取决于客观设计和数值孔径，对比产生的模式，照明光的波长以及子电容器的数值孔径。物镜后焦平面的边缘作为衍射光的低通滤波器，必须将其聚焦在像平面才能发生干涉，并形成粒子或边缘的图像。聚焦显微镜将这些衍射光波在中间像平面处聚集在一起。光波前相对于样本的角度决定了聚焦在通常不包含衍射位置的平滑圆形表面的顶部或底部上的难度。然而，

在讨论相样本时，我们将定义一个对象作为样本的任何可分辨部分。如图4所示，许多物体将是平坦的或板状的。在该图中，物体具有厚度（t）和折射率n（s）。周围介质的折射率是n（m）。

光通过OP = t（n（s））光路穿过样本，并通过光路OP = t（n（m））的周围介质。光程差（OPD）可以表示为：

OPD =（tn（s）-tn（m））= t（n（s）-n（m））

相位差是：

δ=（2π/λ）（OPD）

其中π是常数（3.14159265），λ是照射样本的光的波长。光程差是两个项的乘积：厚度（t）和折射率差（n）。即使物体的厚度很薄，OPD通常也可能很大。另一方面，当样本和周围介质的折射率相等时，即使样本厚度非常大，OPD也为零。在这种情况下，穿过物体的光只是相对于通过相同厚度环绕的光延迟（相位差）。人眼无法检测到相位差异。

在相差显微镜被设计为采取的试样中，并在周围介质中的对象之间的相位差的优势。然而，这不仅仅是必要的相位差，而且相差显微镜也必须发生衍射。

相位对象最常见的形状是连续变化的光路或密度之一，例如图5所示的半球形样本。在这种情况下，相位对象的边可以通过棱镜形状在数学上近似，如下所述。图5中的相位对象的折射率被指定为n（s），而周围介质的折射率被指定为n（m）。相位对象在形状上的基本几何过渡只发生在边缘A和B（见图5（a））。入射光影响垂直于平面AB的物体，而平面波前平行于AB。

1处的边界（图5（a）中圆形相位物体的顶点）基本上平行于入射波阵面，而A和B处的边界是垂直的。区域2到4是由相位对象的圆形表面的切线定义的微型棱镜（图5（b））。区域2处的“棱镜”角度小于区域4处与区域4'相反的角度。在边缘A和B处，衍射最强。

因此，弯曲的物体由许多棱镜组成，并且物体的相对侧具有以相反方向取向的棱镜。最陡的棱镜位于球形物体的赤道上，而斜率最小的棱镜位于顶部和底部。这些微型棱镜形成了一个光学梯度：

OG（光学梯度）=Φ=α（n（s）-n（m））

其中α是切线相对于平面波前的角度。请注意，光学梯度是两项的乘积：光通过的两侧之间的角度（α）与折射率的差异（n（s） - n（m））。穿过棱镜的光线以角度Φ改变方向（见图5（c）和5（d））。如果折射率的差异很大，则即使斜率或边界梯度可能较小，但方向的变化可能较大。如果折射率相同，则光波穿过没有折射的相位物体。从棱镜射出的光线的方向取决于相位物体（n（s））与其周围介质（n（m））之间折射率的相对差异;见图5（c）和5（d））。

如上所述，圆形物体具有连续变化的光学梯度，并且每个单独的光学梯度“棱镜”产生不同的光偏转角度。图5（c）示出了当周围介质的折射率大于相位对象（n（m）> n（s））时的偏转方向，并且图5（d）示出了相反的情况下的方向n（m）<n（s））。偏转角Φ与切角（α）和折射率差（n（s）-n（m））成正比，因此：

tanΦ=tanα（n（s）-n（m））

对于小角度：

Φ=α（n（s）-n（m））（以弧度表示）

为了总结光学梯度边界的“棱镜”效应，当相位物体的折射率超过周围介质的折射率时，物体的每个斜面上相同大小的梯度以相同的角度偏转。该偏转角取决于相对折射率差和几何切线角（α）。当介质的折射率（n（m））大于物体的折射率（n（s））时，偏离情况相反。当没有梯度时，光线不会发生偏转。

光可以通过各种机制与样本相互作用以产生图像对比。这些包括表面反射，吸收，折射，偏振，荧光和衍射。对比度也可以通过对显微镜光学元件和照明模式进行物理修改以及通过照相或数字电子技术操作最终图像来增加。下面的讨论重点介绍了样本和光线之间的各种相互作用，并回顾了一些为增强样本对比度而开发的光学显微镜技术。

当入射光照射到不透明表面时，它将以特定于该表面地形的方式反射。非常光滑的表面以等于入射光的角度反射光线，这种机制称为镜面反射。不均匀或漫反射表面倾向于通过称为漫反射的现象在所有可能的角度反射光，导致进入目标的光量减少。反射光显微镜的对比度可以通过仔细制备标本来加强。通常用反应性液体和气体蚀刻金相样品以显示晶界和/或抛光以增加反射到显微镜中的光量。荧光染料，薄膜和金属涂层形式的污渍也用于在反射光显微镜样本中引入对比度。双折射标本可以使用偏振反射光成像，透明相物体通常是使用反射微分干涉对比度，暗场照明和霍夫曼调制对比等技术进行观察的对象。

人眼对样本中的振幅和波长差异非常敏感。由于这个原因，许多标本被切成非常薄的部分（厚度从1-30微米）并用化学染料染色以增加对比度并区分位于标本内的结构。这种技术在生物样本中已经相当普遍地使用了几百年。染料有选择地吸收一个或几个波长的光线，并通过或反射所有其他波长。一个例子是吸收所有可见光波长的蓝色染料，蓝色除外，蓝色反射并透过样品。生物样本的内部结构元件通常用染料混合物染色以选择性地染色这些元素，

这些技术也适用于荧光染料，可用于提高标本高对比度的特异性。当荧光标本被一种波长的可见光或近紫外光刺激时，它们通常会发出较长波长的光，从而相对于现场或背景中的其他物体（图6）变得可见或对比。荧光显微镜的技术在显微镜底漆的另一部分中详细讨论。