奥林巴斯显微镜三重染色贴壁细胞

  活力和物理的贴壁细胞在培养皿中培养生长特性可以用一个受欢迎的荧光染色，包括一个染色的探针组合很容易确定（线粒体）随着鬼笔环肽（或phallacidin）与低分子量的荧光探针的合成。   在细胞的丝状肌动蛋白细胞骨架的网络可视化的有用的荧光标记中罗丹明，荧光，Alexa Fluor系列，与花青染料。   对染使用流行的各种染料核如下处理与线粒体和肌动蛋白探针。   此协议的细节的广义程序染色各种细胞类型。
图1给出了一个合并的共聚焦显微镜图像堆栈（4光学部分）显示细胞核，线粒体，和在一个正常的喜马拉雅塔尔羊卵巢丝状肌动蛋白网络（  OV HJ1。  线）的上皮细胞。   贴壁细胞培养，详述如下在生长培养基中用MitoTracker Red CMXRos染（红色），其次是鬼笔环肽共轭的Alexa Fluor 488，它的目标是聚合的肌动蛋白（绿色）。   细胞核染色用Hoechst 33342。   标本成像与100X油浸物镜（没有变焦）使用最大的针孔直径设置在奥林巴斯显微镜FluoView fv1000在405纳米的紫激光二极管组合（Hoechst），488纳米的氩离子激光器（Alexa Fluor 488），和一个543纳米氦氖激光（染色）。   图像的灰度通道依次收集并随后pseudocolored逼近的各探针的荧光发射光谱的颜色。   虽然这种荧光结合产生有用的图像，其他探针在红外吸收（如Mitotracker有深红色的633和操纵核染料）可以采用相同的成功。 

试剂
•粒线体介质 -染色的染料是含有50微克的再结晶提供探针瓶。   重建完成与二甲基亚砜（  二甲基亚砜  ）使最终浓度为1毫摩尔的。   二甲基亚砜加入量取决于染料的分子量和如下。   添加DMSO后，涡溶液彻底让混合物坐在黑暗中室温5分钟。   重复的涡流作用，然后离心样品搬迁分散液滴到管底和稀适当的等分试样。   所有染色的染料，稀3微升至10毫升（300纳摩尔终浓度）的生长介质中进行工作的解决方案。 
•MitoTracker Red CMXRos  94微升DMSO每小瓶。 

•粒线体橙CMTMRos  117微升DMSO每小瓶。 

•Mitotracker有绿色FM  74微升DMSO每小瓶。 

•染色的红580  69微升DMSO每小瓶。 

•粒线体的深红色633  92微升DMSO每小瓶。 

•粒线体的洗涤介质  细胞是洗两次完成介质染色的治疗后，需要6毫升冲洗介质在摄氏37度每培养皿。 
•固定剂  准备百分之3.7多聚甲醛溶解在完全生长的含血清培养基使用前。   每个培养皿中大约需要3毫升的培养基。 
•通透性缓冲  百分之0.2的Triton X-100在PBSA（后立即使用30分钟至一小时超声洗涤缓冲）。 
•洗涤缓冲液（通透后） -除了那些需要专门的缓冲区的所有步骤使用“核染料。 
•封闭液  百分之1牛血清蛋白（  牛血清白蛋白  ）在含有百分之0.05的Triton X-100 PBSA（增加2-3毫克叠氮化钠每100毫升缓冲消除微生物的生长）。 
•鬼笔环肽或phallacidin工作液  荧光鬼笔毒肽被提供作为冻干固体含300单位产品。   内容必须溶解在1.5毫升的甲醇产量的最终浓度为每毫升200单位。   一个单位的定义是必要的染色一盖玻片固定细胞的量，相当于5微升的甲醇溶液。   通过稀释原液适量为封闭缓冲液制备的鬼笔环肽或phallacidin工作稀释。   例如，50微升的溶液稀释至1毫升与缓冲将使每使用100微升10盖玻片盖玻片染色。 
•核染色  制备的核染色新鲜稀释前染色。 
•核染色洗涤缓冲液 -赫斯特和SYTOX染料需要汉克斯平衡盐溶液（  汉克斯BSS ），而DAPI，以及单体和二聚体菁核染色，可用于计算。 

核染液稀释
•赫斯特（33342和33258）  稀释在150毫升的汉克斯BSS 5微升10毫克/毫升原液（30分钟治疗）。 
•SYTOX绿色和橙色  稀10微升的浓缩原液（二甲基亚砜5毫摩尔）在250毫升的汉克斯BSS（30分钟治疗）。 
•DAPI 稀150毫升PBSA稀释百分之50双蒸馏水5微升10毫克/毫升原液（5分钟治疗）。 

程序

注：染色处理对活细胞贴壁。  从生长的细胞去除介质和更换预热（37摄氏度）含药血清并在适当浓度的粒线体探针介质（约350-400纳摩尔）。   培养细胞在二氧化碳培养箱45到60分钟。 

 从培养皿的粒线体中吸出，加入3毫升的预热（37摄氏度）每60毫米培养皿中。   将清洗介质在37度5分钟允许未绑定的粒线体扩散到介质。   重复此过程，一旦固定前。 

 固定细胞贴壁快吸最后介质清洗和预加百分之3.7多聚甲醛热（37度）的完全培养基，包括血清。   使细胞孵育15分钟，在固定器在37摄氏度。 

 固定后，用洗涤液洗三PBSA变化的细胞（2至5分钟洗）。   慢慢旋转含有盖玻片培养皿作为他们被洗涤在轨道摇床转速每分钟5-10。 

 溶解的贴壁细胞膜具有10至15分钟的缓冲处理法。   慢慢旋转含有盖玻片培养皿所透在轨道摇床转速每分钟5-10。 

 通透后，随着PBSA Triton洗涤液洗涤细胞三的变化（每5分钟洗）。   慢慢旋转含有盖玻片培养皿作为他们被洗涤在轨道摇床转速每分钟5-10。 

 块非特异性鬼笔环肽（或phallacidin）阻断1小时的缓冲区的结合位点。   慢慢旋转含有盖玻片培养皿都被封锁在轨道摇床转速每分钟5-10。 

盖玻片染色的支持
 准备染色的鬼笔环肽支持覆盖2×3英寸的显微镜载玻片和封口膜，如图2所示。   确保封口膜使其紧密附着并沿玻璃表面的均匀分布（无水泡）。   阻断后，小心地取出盖玻片从培养皿放细胞侧下阻断沉积在膜缓冲稀释的鬼笔环肽100微升滴盖滑。   在3和6上可以放置在一个单一的幻灯片。   下一步，将幻灯片在湿度室用铝箔覆盖保护荧光光（见图3）。   将盖幻灯片在湿度室30分钟在室温。 

 鬼笔环肽治疗后，彩色盖玻片返回他们各自的Petri菜洗三次PBSA Triton洗涤缓冲液（每5分钟洗）。   盖上皿盖用铝箔或铝烤盘（防止光）和缓慢旋转的细胞，他们被洗涤在轨道摇床转速每分钟5-10。 

DAPI和菁核counterstains，加入稀释的染料在PBSA到培养皿和治疗的贴壁细胞的推荐时间：5-10分钟DAPI；15-30分钟菁染料（保护铝箔光）。   当使用Hoechst或SYTOX污渍（30分钟的孵育），先洗细胞汉克斯平衡盐溶液三缓冲交流之前，复染。
与PBSA或汉克斯平衡盐溶液洗涤染色细胞（取决于核染料）三次，每5分钟洗。   从保护铝箔光。   彻底清洗在这个阶段要删除所有的痕迹，未结合的鬼笔环肽是必要的（或phallacidin）。 

 为了去除多余的盐分，洗涤细胞三次，2～3分钟（每洗）在蒸馏水。   请注意，这一步是必要的如果盖玻片被风干过夜之前安装。 

 最后的蒸馏水洗涤步骤之后，小心地取出盖玻片用镊子从培养皿，擦去多余的水从背面和边。   精益的盖玻片上培养皿盖两侧对标记，让他们干通宵。   保护干燥盖玻片与铝烤盘的光。   干燥后，将盖玻片（细胞的一面朝下）在干净的载玻片使用适当的安装介质。