什么是落射荧光显微镜

荧光团

荧光现象发生在特定波长的光（激发光）被物质吸收时，当物质从激发态返回到基态时，它释放出能量时发出光。许多荧光物质（称为荧光团）已被开发用于不同的用途，激发波长范围从紫外到红外。然而，发射波长通常比引起它们的激发能量的波长长。

落射荧光显微镜

是落射荧光显微镜指设计用于观察上述荧光团的显微镜。光学系统包含用于激发的光源（通常为汞灯）和用于将激发光与荧光分离的滤光器块。有许多过滤块可用于不同类型的荧光基团，可随时切换连续观察多种荧光染料的标本。

激发块在外荧光显微镜中的作用

如图1所示，激发块由两种过滤器和一个分色镜构成。选择适当的过滤器和镜子，使研究人员能够获得荧光和背景光之间的高信噪比（S / N）。以下描述这些光学元件的功能。

激发滤波器（EX）

激发滤波器是仅使从激发光源（通常为汞灯）激发所需的光的波长通过到荧光团的光学元件。如图2所示，只有激发波长通过滤波器，通常是一个“带通滤波器”。

分色镜（DM）

二向色镜是将激发光与荧光分开的光学元件。分色镜是特殊的反射镜，仅反射特定波长的光，允许所有其他波长通过（图3）。落射荧光显微镜滤光片块中使用的分色镜以45°的入射角照射光，形成反射光的“阻带”和透射光的“带通”。通过激发滤光片的光线被90°反射到物镜和样品上。最后，从样本发出的光线通过并指向观察者（或高灵敏度相机）。

屏障滤波器（BA）或发射（EM）滤波器

屏障过滤器是将荧光发出的荧光与其他背景光分开的光学元件。如图4所示，屏障滤光器透射通过分色镜的荧光波长的光，同时阻挡从激发灯泄漏的所有其它光（从样本或光学元件反射）。这是必要的，因为荧光灯的强度比激发光弱100,000倍以上。大多数屏障过滤器被放置在一个很小的角度，以通过抑制重影图像来实现更好的荧光成像。

尼康的噪音终结者

尼康的落射荧光显微镜有专有的尼康光学元件，被称为“噪音终结器”（型号TE2000及更高版本）。如图1所示，噪声终止器允许通过防止激发光在滤光片块内散射并泄漏到观察图像中而有效地处理透过分色镜的光。这有助于消除背景光噪音和更有效的荧光图像。

选择荧光过滤器和镜子

选择荧光滤光片和反射镜时应遵循以下步骤。

荧光团（荧光物质）的波长

确定使用的荧光团的波长。这些信息在目录中有记载，但荧光基团的波长特性也会根据溶液条件（如盐度，pH值和细胞内条件）而稍有变化。因此，我们建议使用荧光计来测量激发和荧光波长。然后，使用这些信息来选择最合适的光学元件。

分色镜选择

选择的分色镜必须有效地分离激发光和荧光的波长。具体而言，必须通过将反射镜放置在45°入射角时将反射镜的特性曲线与荧光团的波长进行比较来找到透射率截止在荧光团的激发波长与其荧光波长之间的二向色镜。

如果荧光团的激发波长和荧光波长接近，斯托克（Stoke）位移（注1）较小，则应选择截止波长较小的反射镜，以尽可能多地使荧光信号通过。

屏障过滤器选择

选择一个允许样品荧光波长通过的过滤器。通常，在带通滤波器上选择传输长波长的长通滤波器。然而，当从多重染色的样本分离波长时，或者当使用对较长波长敏感的相机时，不传输这些较长波长的带通滤波器通常用作屏障滤波器。

激发滤波器选择

选择一个允许激发波长平稳通过的滤波器。尤其是当使用汞灯作为光源时，通过将汞灯的线谱结合到波长中来实现有效的激发。允许除物镜荧光团的激发波长之外的波长通过将增加背景光并破坏样品。如图7所示，对于440nm的波长，激发效率较低。

屏障滤波器和激发滤波器的组合

屏障滤光片和激发滤光片的理想组合是一种不让光线通过的组合。发出的荧光非常弱，所以任何通过滤光片泄漏的光都会降低图像质量。

获得明亮的荧光图像

有时建议去除激发光学中的ND滤光片，并增加激发光源的强度。然而，增加激发光源的强度会使荧光团快速漂白并损坏样品，并增加电池中的自发荧光（注2）。由于这些原因，光源应该尽可能地弱，并且观察光学器件尽可能高效地拾取荧光信号（通过扩大目标孔径，增加荧光滤波器的波段，使用更灵敏的相机等）。

[注1]斯托克变换是指激发能量与荧光能量之间的能量差异，因能量在热荧光材料中从激发态回落到其基态时的热能部分损失而产生。（岩波书店理化辞典）

[注2]自发荧光是指荧光物质在除荧光物质以外的物质中的存在。例如，细胞成分如NAADPH或核黄素在未染色的细胞中在短波长范围（紫外至可见光）中发出相对较强的荧光。

减少漂白

您可以采取以下步骤来减少漂白。

使用抗漂白剂

对苯二胺等防漂剂可用于FITC，罗丹明可用正丙基镓。

使用ND滤镜

在显微镜上使用中性密度或ND滤光片，将光线水平降低到观察所需的最低水平。有时这可能需要将滤波器设置为100％，同时采取措施尽可能不分割光路。

使用抗漂白荧光团

使用可用于每个测试目的的最漂白的荧光团。