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徕卡显微镜 - 荧光寿命成像之FLIM-FRET应用浅析
发布时间:2021-04-22 08:25:24 | 浏览次数:

徕卡显微镜 - 荧光寿命成像之FLIM-FRET应用浅析

FRET 技术(Fluorescence Resonance Energy Transfer)能够在突破传统光学分辨率极限的条件下研究蛋白互作、构象变化(<10 nm),或者通过构建 FRET 探针监测分子变化,因而在诸多研究领域得到了“科研大拿”们的青睐。然而,传统的基于荧光强度的 FRET 技术(如 FRET-AB、FRET-SE 等)容易受到荧光蛋白浓度、激光强度、荧光漂白等众多因素的影响,从而直接导致了实验结果的不准确性和难重复性,着实让人头疼!


奥林巴斯显微镜

△ 图1. 常用 FRET 染料对 Alexa488-Cy3 的 Jablonski 图表



FLIM 显微成像技术

FLIM-FRET 的优势

FLIM(Fluorescence Life-time Imaging Microscopy) 是一项基于荧光寿命(电子驻留在激发态的时间统计值)的显微成像技术。与荧光光谱一样,荧光寿命也是荧光物质的一种内在特有性质,不受荧光物质浓度、激发光强度等因素的影响。基于荧光寿命测量的 FRET 技术—— FLIM-FRET,具有 FLIM 和 FRET 两者的优势,即能在不受荧光强度影响因素影响的条件下,在纳米分辨率水平对蛋白互作进行研究,或者通过 FRET 探针研究分子环境变化,更重要的是其测量数据准确性高、易重复,接下来我们来看两个例子。


案例解析


案例一

离子溶度监测

今年发表在 Nature Immunology 上的文章 “An essential role for the Zn2+ transporter ZIP7 in B cell development” 研究了 ZIP7 蛋白在 B 细胞中的重要作用。


作者通过对免疫缺陷病人进行基因筛查,发现了 ZIP7 蛋白的缺失,利用 CRISPR-CAS9 技术构建了该基因缺失的小鼠模型,并利用该模型证明了 ZIP7 缺失会导致 B 细胞发育受阻。ZIP7 介导 Zn2+ 由内质网流入细胞质,为了证明 ZIP7 缺失的细胞中 Zn2+ 浓度受到了影响,作者通过 FRET 探针 eCALWY-4、eCALWY-6 进行了研究,然而传统的FRET技术会受到探针浓度的影响从而导致结果不准确,因此作者利用了 FLIM-FRET 技术,证明 ZIP7 突变体细胞质中 Zn2+ 浓度明显下降,后续的实验进一步证明了 ZIP7 调控的 Zn2+ 水平对 B 细胞发育的重要性。

奥林巴斯显微镜

△ 图2. 利用 FLIM-FRET 技术检测细胞质和内质网中 Zn2+ 浓度。P198A Hom,ZIP7 突变体;eCALWY-4、eCALWY-6 ,Zn2+  FRET reporters ; ER,内质网



案例二

活体功能成像

FRET 探针不仅可用在细胞水平,in vivo 个体水平也同样适用。


“Removing physiological motion from intravital and clinical functional imaging data” 一文利用 Rac1 FRET 探针对小鼠小肠、胰腺等组织中的 Rac1 活性进行了监测。然而,传统的 FLIM 技术成像速度非常慢,在活体应用时,由于时间分辨率不够会导致数据的假象。该文通过算法将这种成像速度不够导致的假象进行了*大程度的消除,从而在一定程度上促进了 FLIM 在活体水平的应用,该文章发表在2018年 eLife 杂志上。

奥林巴斯显微镜

△ 图3. 左,Rac1 FRET 探针检测小肠隐窝处 Rac1 活性模式图;右,运动补偿运算前后 FLIM 数据对比



SP8 FALCON *快速荧光寿命成像

解决 FLIM 成像速度*大瓶颈

当然, FLIM 应用并不仅限于 FLIM-FRET,通过 FLIM 还可以对样本所处的微环境进行检测、对样品组份进行分离等等。在传统的荧光强度和荧光光谱两个维度的基础上,又增加了荧光寿命这一新的成像维度,大大拓展了该系统的应用范围。


然而,正如 Sean C Warren eLife 文章所说,FLIM 成像速度慢是限制其应用的*大瓶颈。


Leica*新 SP8 FALCON *快速荧光寿命成像解决方案,使 FLIM 成像速度提升了近10倍(较经典 TCSPC 方法),近共聚焦的成像的速度几乎能满足所有动态过程的速度要求,可轻松实现 XYZTλ 多方式快速荧光寿命成像


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