相差显微镜的原理

光波三要素：频率，代表光的波长或颜色；振幅，代表光的强度；相位，代表波的相对位移。

光在穿过非真空的介质时，会发生振幅和相位的改变。其中，振幅的改变取决于介质对于光的吸收和散射，通常与光的波长，也就是颜色有关。成像设备和人类的肉眼只能感受到振幅的变化。对于透明的生物细胞样本，光在透过样本后，振幅基本无变化，因此肉眼很难观察到。

相位的改变包含很重要的信息，但是不能被直接观察到。

在相差显微镜出现之前，人们要观察透明细胞时，需要对细胞进行染色，才能被观察到。这就需要特殊的染色操作，并且细胞也会死亡。相差显微镜就可以观察未经染色的透明细胞，可以保持细胞形态和特征。

相差成像技术在1953年获得了诺贝尔奖，所以，应用相差技术的相差显微镜也算是星二代啦~

环形照明光（绿色）通过聚光镜聚焦到样本，部分光被样本散射（黄色），其余的光没有变化，穿过样本形成背景（红色）。

当样本没有染色时，散射光会很弱，而且通常与背景光有-90度的相位差。此时前向光与背景透射光强度非常接近，因此反差很小，不易观察。

在相差显微镜中，物镜后方会有一个相差环，使样本的散射光产生-90度相位变化，与散射光和背景光同向，从而增大前向光与背景光反差。

通过第二个灰度滤光片，使散射光和背景光都有一定程度降低，由于背景光降低的程度比散射光降低程度大，因此前向光与背景光反差进一步增大，更容易被观察到。

以上是负相差，前向光比背景光强，视野内样本成像比周围背景亮。

目前相差显微镜通常采用正相差。正相差与负相差相反，是使背景光产生-90度相位变化，背景光与散射光方向相反，前向光比背景光暗，样本细节成像更明显。

倒置显微镜常配置相差成像技术，用于透明的生物细胞观察。相差成像对细胞容器没有特殊要求，塑料培养皿即可，便于培养细胞的连续观察。

相差成像技术中，样本周围会产生“光晕”，尤其是在比较大的颗粒如整个细胞周围，使图像产生混乱。但“光晕”也可以增强样本与背景的差异，尤其是增强薄的边缘的细节反差。