奥林巴斯显微镜信号噪声的注意事项

光学理论提供分辨率显微镜是由光学系统的数值孔径和用于形成图像的光的波长。   为了在实践中是有意义的，然而，分辨率必须从对比度的定义，并从标本，最终确定信号的电平的测量不确定度的收集的光子数，因此，可以实现图像的对比度。   在激光扫描共焦显微术，特别是在生物材料，信号电平通常是低，由于在聚焦光束从小型荧光探针体积光获得数量有限。 

 典型的共聚焦和宽视场显微镜的数字图像的具有不同程度的信号电平的比较示于图用小针孔孔径在共聚焦显微镜产生的图像采集一薄的光学部分具有高对比度和相对低的信号 - 噪声比时大量的荧光标记的情况下（图1（a），在样本为小鼠肾脏的三重标记薄膜部）。然而，在较低的探针浓度，光强度快速下降，将所得的共焦图象，由于信号电平低（图1（b）），看起来更粗糙。试样在图1所示的宽视场荧光图像（a）和图1（b）中包括（图1（c）），以表明降解从区域远离物镜焦平面产生荧光的问题。 

 在利用数字显微镜技术，包括共焦方法中，信号采样对的效果对比和分辨率成像能力的任何定量评估必须加以考虑。所测量的信号电平值不直接代表由标本发出或散射光子的数量，但是成比例的数量。另外，信号强度的每个单独样品是只收集光子的数目的近似，并且会随重复测量的变化，被称为噪声，赋予强度的定量化的不确定性，因此在图像数据的对比度和分辨率。尽管采样的影响可以相当容易地估计，在一个单一的像素噪声的确定是更加成问题的。 

 在透射或反射的对比机制，检体的信号强度（光子数）通常是非常高的，并且主要噪声源是电子噪声的仪器，或者在某些情况下，在照明强度的波动。当荧光发射被用于成像的光子数目通常非常小，并且在检测到的光子，或泊松噪声的数量的统计变化，将成为最显著变量。图2示出噪声的增加的不确定性所采样的强度值在从成像2点状试样的特性所造成的艾里图案的效果。 

 而不是用一个噪声和图像特性的影响的数学评估开始，它是考虑在概念上的噪声和有用的机制  信噪比  影响成像。   在强度测定的不确定性，并基于强度测量值的对比，在对比度降低的结果。   任何对比度降低，降低的截止距离，退化的分辨率（相对于一个给定的对比度）在检测到的信号从噪声的结果。   它相对于信号噪声水平影响成像能力，可以在一个单独的图像的像素区分灰度级的数目进一步的机制，这实际上建立在图像动态范围的限制。   有效的动态范围可以被认为是信号的比率除以噪声。   由于噪声，由于其在荧光显微镜下泊松特性，相当于平均信号的平方根，动态范围信号划分为信号的平方根，因此是相当于信号的平方根。 

当噪声样本信号的贡献是，它本质上提高信号电平“地板”，下面的对比不足存在样本点特征之间使他们能够作为独立的。   在绘制对比距离函数显示分辨率的限制，一般忽略噪声和承担无限高的信噪比和动态范围。   间距要求提供足够的对比度来“解决”两个图像特征的噪声被认为是增加时，所需的能见度和对比水平必须到一个更高的对比度水平确定最小可用。   当使用对比范围不再延伸到零的情况，如图3所示的存在，在一个恒定的任意噪声限制使用对比点分离范围。 

 采取的提高通过减少在试样上的焦斑尺寸的决议将导致在激发荧光团的数量减少，因此在光子可以收集数的步骤，这意味着更高的噪声电平。   在噪声的相对信号和动态范围的极限分辨率的提高，可以通过减少强度的点扩散函数的尺寸达到减少增加（  PSF 在共聚焦显微镜）。   当观察体积减小的点扩散函数小，采样周期必须增加以保持相同的信噪比，一种策略，往往不是由于同时增加光子通量在标本完整性的有害影响，荧光饱和度选项。 

 与探测器针孔是无穷小的只有严格获得共焦成像的影响，产生的图像信号电平太低是有用的。   在另一个极端，一个非常大的针孔选择最大化样本信号将消除聚焦优势完全。   在实践中，一个最佳的针孔大小必须选择最大的标本信息的记录，并考虑到显微镜配置，其运作模式，和试样的特性。 

 如前所述，在生物荧光显微镜应用的整体信号的水平通常是低的几个原因，其中之一是荧光光漂白后的照明是一个因素，必须通过限制激发光总暴露最小化。   这有效地限制了可用于检测的光子数的增加，对检测过程的统计性质引起的信号变化的意义。   这种噪声通常被称为  散粒噪声  或  光子噪声  是由于光的粒子性和发射光子的离散的电特性。   实际上，在检测器中的光子到达时间的随机波动是负责的散粒噪声。   在低信号电平，噪声降低，可以在一个图像的歧视和对图像质量有一个整体的降解效果的灰度级的数目。 

 当所有的噪声源被认为是，信噪比（  S / N ）可以被用来作为衡量的整体图像质量。   如果噪声是唯一显着的噪声分量的检测信号在激光共聚焦显微镜，信噪比会随着针孔大小的直接增加，使价值得到提高在这一点上针孔的直径变得过大，达到理想的共焦光学切片的影响。   这是没有的情况下，然而，和一个额外的统计噪声源的背景荧光源自外部利益的平面荧光和从试样的荧光和光学元件介绍（包括透镜水泥），这两个限制相对于背景的特征对比试样。 

 由于样本特征不相关的背景信号的信噪比下降，实际上非常大的针孔大小（或在一个针孔缺失）。   在理论上理想的聚焦装置，信号背景（  S / B ）比最大时，探测器的针孔孔径直径有零。   因为这样的一种孔径会排除信号及背景，然而，它没有实际应用。   在一个有用的显微镜，孔径大小必须增加，以提高信噪比。   在一般情况下，一个最佳的孔径尺寸存在的最大信噪比，同时保持足够的图像对比度好的信号背景比。 

 增加在试样入射激光功率是另一种机制，可以用来增加的信号电平，并提高信噪比。   然而在实践中，这一策略，通过任何改善的现象有限公司简称  荧光饱和  ，其荧光发射强度达到最大值，不额外增加激光功率输入。   这种非线性响应的结果利用激光照射强烈的荧光分子往往数量有限的很大一部分被提升到激发态（人口减少地面状态）。   效果是降低明显的荧光团的浓度，以及由此产生的不可预知的荧光基团的浓度和排放强度之间的关系复杂数据的解释。   因此，荧光信号可通过漂白或饱和度的限制，在信噪比大大不同的相对影响，并与不同的限制的各种显微结构的性能。 

 由于漂白或饱和信号强度的限制是荧光显微镜在生物材料进行特别是至关重要的，这是最常见的应用共聚焦仪器。   负责公司发射信号的现象是曝光过度的时间和/或强度有关。   与其他的对比度增强利用反射或透射光的结合或免疫金标记染色的机制或方法，利用相位对比差异，在试件破坏是一种可能性，激光强度存在类似的限制。   然而，漂白是在非荧光技术的一个因素，并没有限制对信号的采集，在很长一段时间如果加热或其他长期光照不破坏试样。 

 因为显微镜的分辨率是离不开的对比，和对比度是依赖于信号的信噪比，对试件的功能可见性所需要的阈值对比最终是有限的由检测到的光子数。   与典型的荧光显微镜光子数量有限，衍射极限分辨率不实用的仪器操作来实现的，它是必不可少的，光子的数量是由成像序列的每元优化最大化。   相对于在共焦成像信号的噪声，散粒噪声，或光子噪声，是因为它带来了根本的限制信号的信噪比，最重要的。   在从信号的光子的到达特性的波动相关的散粒噪声是外部的探测器本身并不能减少。   波动的背景光子到达的贡献（背景噪声）可以减少，这是通过限制检测器的背景信号接受最常见的实现。 

 在检测到的光子信号本身的统计变化是由一个泊松分布函数，它趋向于正态分布在足够大的数量的光子的参与。   这样的分布，它的平均值等于其方差的性质。   因为拍摄的噪声方差的平方根，一个信号组成的  N 光子，信噪比是由： 

 信号噪声  (S/N) = n/(n1/2) = n1/2

在一个理想的显微镜，只有光散粒噪声限制的图像质量。   如果没有背景信号存在，信噪比是一个简单的方式进行评估，由上式说明。   在一个实际的显微镜，背景噪声的存在也必须考虑加在信号和噪声的噪声分量之间的关系。   如果信号背景比大，几乎所有检测到的光子代表图像信息，和信噪比接近的值由给定的方程表示。   如果背景贡献大（小信号背景比），所需的信号可能会丢失在高背景噪声，使信噪比接近零。   对比情况如图4所示，其中计算的图像的强度分布的点源，提出了两种不同的恒定的背景信号电平。   图4（a），背景强度相等的点源强度（以上）导致1的信号背景比。   与背景水平高125倍，由图4所示的强度分布（B），所产生的图像不允许从高背景点特征的歧视。 

 共聚焦显微镜的最佳操作需要试图平衡利用在前面的检测器的孔径的相互矛盾的要求，这是负责传授的共焦配置的有利方面，对信号的减少，孔径也产生。   有一个圆形的（针孔）孔直径的增加，增加了总的信号电平，但减小轴向分辨率，这表明一些妥协的孔径大小设置是可取的。   当荧光技术的采用，弱信号的水平是实现最佳的图像质量有明显的局限性。   虽然多通道扫描和图像的平均技术可以弥补低信号电平，这种失败的优点是快速扫描系统，可应用于动态过程的研究在生物。   平均技术，另外一个缺点是，系统中的光学缺陷产生任何噪音，如耀斑和光学元件散射，提高随着信号，从而增加亮度的图像质量不相称的改善。 

 处理在共聚焦荧光显微镜配置过度的背景噪声的实际的策略是减少为探测器的孔径尺寸排除更多的背景噪声，从而增加的信号背景和信噪比。   随着孔径的直径减小，然而，一个点达到信号还原变得比背景更显着减少，与信噪比的降低。   这是显而易见的，因此，一个孔径大小可以发现，最大限度地提高信噪比，并能对信号与背景之间的关系的基础上确定的。   光圈的大小被确定是关于图像质量最佳的可能不符合最大对比度和分辨率，但并最大限度地提高图像中标本信息。   最大的成就，有用信号，进行标本信息，是优化性能的基础上，在荧光显微镜。 

 在共聚焦显微镜激光聚焦到样品和分布的点扩散函数。   发射的荧光，被收集和传送到图像平面后再分布的光学系统的点扩散函数，具有垂直强度分布如图5所示，水平。   的点扩散函数的强度分布的宽度是指示性的显微镜的分辨率。   纵向分辨率是一个光轴方向上的强度分布函数，而在焦点的点扩散函数是常见的通风方式，这决定了横向分辨率。   第一个零（最小），在从光轴的距离3.8无量纲单位发生，对应于横向分辨率瑞利判据。   为了实现聚焦操作，所发射的光子通过允许只有那些通过在图像平面在前面的检测器的检测孔通过空间滤波。   最大的空间滤波和背景抑制发生（理论上）的孔半径（  R ）等于零。   作为  R 增加承认可用光水平，共聚焦特性降低到，在大孔半径，显微镜作为一个传统的宽场仪。 

 一种光学系统的点扩散函数的强度以绝对的尺寸取决于成像配置，并根据不同的放大倍率，照明的波长，光学系统的数值孔径，和折射率介质通过它的光的传播。   对于不同的显微镜和其他光学系统为代表的利用无量纲的成像特性，这是习惯  光学单元  是独立的光学系统（例如，距离3.8单位从光轴的第一最小的通风模式）。   这些单位是由在横向和纵向方向相关的特定的光学性能规范衍生的距离。   横向距离值的波长和数值孔径，归一化，同样，纵向值归一化波长，数值孔径，和试样的介质的折射率。   因为相对于光学性质的成像性能评估的目的，是来代表变量如针孔大小的无量纲的光学单元，这些有用的，和一个独立的仪器  归一化针孔半径  可以以这种方式定义。 

 横向和纵向距离（  V 和  U ，分别）可以被归一化的宽度和点扩散函数的轴向尺寸，通过变换光学单元采用下列方程： 

v = k • (NA) • r

u = k • ((NA)2 • z)/n

在这  R 从光轴的横向距离代表，  Z 从焦平面的轴向距离，  钠  数值孔径，  N 代表的折射率，并在每个方程，  K 采用波长（  λ ）的关系  ：

k = 2 π / λ

为了与不同的探测器针孔大小的评价共聚焦仪器的性能，归一化的针孔半径  V（D）  可以从以前的方程如下，一个针孔半径  R（D）  ： 

vd = k • rd • NA

荧光信号可以从一个点源在焦平面上使用的探测器孔径，当收集半径  V（D）  可以通过考虑点源的荧光团的数量计算，吸收截面，和荧光量子效率。   发出的光子的到达像平面的比例分布的通风模式，当集成在探测器孔径半径乘以实际采集到的信号检测的效率收益。   图6（a）提出了图形之间的典型关系规范化采集的信号从理论的点源和探测器孔径半径，在光学单元。   关于信号在孔排除了，很明显，需要产生最佳的共焦成像性能的小的孔，将拒绝大部分的发射信号。   相反，开孔孔径承认一个较大比例的发射信号是有利的为点多余的背景的对比度降低，变得不可接受。   几个计算孔产生最佳信噪比的范围大约在2到3（表示在图上的曲线，一个红色的部分图6（a）），这取决于相对于背景信号量。   它通常被认为是可取的许多类型的调查收集至少百分之50的总的可用荧光，这是孔径大于约2光学单元很容易实现，同时仍保留优异的图像的对比度。 

 因为达到足够的信号电平和足够的背景抑制获得最佳聚焦性能是必要的评估和信噪比的信号背景比的要求相结合。   背景许多不同的模式（有时称为杂散光）已在文献中提出的，他们不同的适用于不同类型的标本，仪器的配置，以及是否反映信号或荧光成像检测。   在一些模型中，背景是假定为恒定的强度在整个检测器的平面，与部分穿过针孔是与其面积成正比。   这种模式被发现在共焦反射结构的描述是有用的，其中重要的背景是由于散射在显微镜下，从光学元件反射的光路。 

 其他的模型被认为是更适合于荧光显微镜，和这些不同了，信号和背景来源于空间要素的程度的假设，即在某些情况下，任意的，可变的。   至少一个模型的应力场的大小减少在降低噪声的一个因素，并假定一个无限的试样厚度的有限域的大小。   在这种情况下，如果背景是均匀地从一个三维荧光试样相比，点扩展函数的大，它可能代表了荧光背景特征伴随着荧光标记从一个合适的模型。   计算信号的信噪比，背景，内容，和信号背景比出现在众多的文学表现，并从这些，一定的概括是可能的基础上的理论和实验的共焦成像的针孔大小的因素，优化性能的测定。 

 在具有荧光均匀分布的试样，由于照明光束的光强分布，激发荧光相同的分数是在传统的宽视场显微镜收集从每个焦平面。   作为一个结果，背景信号与线性增加试样的厚度。   一个关键属性的共聚焦显微镜，然而，这是不包括光探测器孔径以外的焦平面的大多数，如果相比景深厚度较大，背景信号的电平接近试样厚度独立。   当一个均匀的荧光浓度假定的背景信号，收集不同的试样厚度的计算表明，循环探测器针孔半径大于或等于试样厚度的收集所有的样品的荧光，致使广角镜的性能等价。 

 小针孔大小，背景是从试样的飞机比半孔半径的焦平面减少，并作为针孔半径是低于约四分之一的试样的厚度与孔径大小，背景呈线性减小。   在孔径尺寸小于约4光学单元，只有约的背景进入检测器百分之1取得了有益的共焦成像特性，在一个适度的信号可能损失百分之25试样的厚度为几百倍的孔径大小。 

 考虑到试样厚度的影响及探测器孔径大小对背景抑制允许为每个不同的值的信号背景比的计算。   当这些计算理论与理想的共焦配置具有零探测器孔径进行不同试样厚度（最大化的信号背景比），信号的变化的背景下，已被证明是基本上是独立的试样厚度的值大于约100的光学单元。   当信号背景归一化值为一零孔半径，绘制量为厚的样品，结果在一个曲线相似，如图6所示的函数的孔半径（B）。   孔径大小，最大限度地提高信噪比的范围（如图6也说明（一））曲线的红色部分表示。   信号背景比直接表示图像的对比度，虽然最大比实际上不可能实现由于孔的尺寸必须增加承认适当的信号，它是重要的，合理的对比可在光圈的大小，产生最佳的信噪比。 

 应当指出的是，虽然理论和实验证据表明，最佳的孔径大小可以确定，其中最大的轴向和横向的共聚焦显微镜的分辨率，有许多因素有助于选择妥协的孔径尺寸满足在特定情况下的成像要求。   最佳光圈大小通常不是一个产生的最大分辨率。   在典型的实验意义更大的是携带信息的光子可以区分从背景信号和其他噪声源的一个可行的时间框架内的数量。   最重要的变量包括样品的特性（如厚度），荧光或其他成像信号产生的信号电平，伴随着信号的噪声水平，时间约束的信号采集的荧光团漂白或试样施加的变化，和特定的显微镜配置下考虑。